Ο Κορονοϊός, το Εμβόλιο και μια Σουηδική Έρευνα βόμβα

Ο Κορονοϊός, το Εμβόλιο και μια Σουηδική Έρευνα βόμβα

Μια λέξη μπορεί να σου τραβήξει την προσοχή και μετά να φας ολόκληρη την ημέρα και στο τέλος να έχεις ξεφύγει σε εντελώς άλλα θέματα.

Αφορμή στάθηκε ένα ημαιηλ που έλαβα από ένα φίλο, και το οποίο αφορούσε σε ένα άρθρο του κυρίου Κλεάνθη Γρίβα στην Ζούγκλα , όπου στήριξε τα γραφόμενα του σε μια ερευνητική εργασία την οποία και παραθέτει. Kαι μάλιστα αποκάλεσε την έρευνα βόμβα γι αυτό και τράβηξε την προσοχή μου. Τελικά η βόμβα βρίσκεται αλλού.

Θεοφάνης Α. Τσαπικούνης

Μάλλον ο κος Γρίβας θα υπέθεσε ότι: ποιος θα κάτσει να διαβάσει τώρα το paper (πεϊπερ); Αλλά προφανώς το διάβασαν πολλοί. Το διάβασα και εγώ και σας παραθέτω τα συμπεράσματα μου.

Ακολουθεί η παράθεση τμημάτων από το πεϊπερ και ακολούθως τα σχόλια μου και στο τέλος οι εκτιμήσεις μου.

Τίτλος:

SARS–CoV–2 Spike Impairs DNA Damage Repair and Inhibits

V(D)J Recombination In Vitro

Συγγραφείς:

Hui Jiang 1,2,* and Ya-Fang Mei 2,*

Περιοδικό και θέση στο web:

Viruses 2021, 13, 2056. https://doi.org/10.3390/v13102056

https://www.mdpi.com/journal/viruses

1

Department of Molecular Biosciences, The Wenner–Gren Institute, Stockholm University,

SE-10691 Stockholm, Sweden 2 Department of Clinical Microbiology, Virology, Umeå University, SE-90185 Umeå, Sweden * Correspondence: hui.jiang@su.se (H.J.); ya-fang.mei@umu.se (Y.-F.M.)

Abstract:

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS–CoV–2) has led to the coron-

avirus disease 2019 (COVID–19) pandemic, severely affecting public health and the global economy. Adaptive immunity plays a crucial role in fighting against SARS–CoV–2 infection and directly in-fluences the clinical outcomes of patients. Clinical studies have indicated that patients with severe COVID–19 exhibit delayed and weak adaptive immune responses; however, the mechanism by which SARS–CoV–2 impedes adaptive immunity remains unclear. Here, by using an in vitro cell line, we report that the SARS–CoV–2 spike protein significantly inhibits DNA damage repair, which is required for effective V(D)J recombination in adaptive immunity. Mechanistically, we found that the spike protein localizes in the nucleus and inhibits DNA damage repair by impeding key DNA repair protein BRCA1 and 53BP1 recruitment to the damage site. Our findings reveal a potential molecular mechanism by which the spike protein might impede adaptive immunity and underscore the potential side effects of full-length spike-based vaccines.

Keywords: SARS–CoV–2; spike; DNA damage repair; V(D)J recombination; vaccine

Μετάφραση στα Ελληνικά

Περίληψη

Το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο κοροναϊός 2 (SARS–CoV–2) έχει οδηγήσει στην Πανδημία της νόσου του κορωνοϊού 2019 (COVID-19), που επηρεάζει σοβαρά τη δημόσια υγεία και την παγκόσμια οικονομία. Η προσαρμοστική ανοσία παίζει καθοριστικό ρόλο στην καταπολέμηση της λοίμωξης SARS-CoV-2 και επηρεάζει άμεσα την κλινική έκβαση των ασθενών. Κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι οι ασθενείς με σοβαρή COVID-19 εμφανίζουν καθυστερημένες και αδύναμες προσαρμοστικές ανοσολογικές αποκρίσεις. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο ο SARS-CoV-2 εμποδίζει την προσαρμοστική ανοσία παραμένει ασαφής. Εδώ, χρησιμοποιώντας μια in vitro κυτταρική σειρά, αναφέρουμε ότι η πρωτεΐνη ακίδας SARS-CoV-2 αναστέλλει σημαντικά την επιδιόρθωση βλάβης του DNA, η οποία απαιτείται για τον αποτελεσματικό ανασυνδυασμό V(D)J στην προσαρμοστική ανοσία. Μηχανιστικά, βρήκαμε ότι η πρωτεΐνη ακίδας εντοπίζεται στον πυρήνα και αναστέλλει την επιδιόρθωση βλάβης του DNA εμποδίζοντας τη στρατολόγηση της βασικής πρωτεΐνης επισκευής DNA BRCA1 και 53BP1 στο σημείο της βλάβης. Τα ευρήματά μας αποκαλύπτουν έναν πιθανό μοριακό μηχανισμό με τον οποίο η πρωτεΐνη ακίδας πιθανόν να εμποδίσει την προσαρμοστική ανοσία και υπογραμμίζει τις πιθανές παρενέργειες των εμβολίων που βασίζονται σε ακίδες πλήρους μήκους.

2. Materials and Methods

2.1. Antibodies and Reagents

2.2. Plasmids

2.3. Cells and Cell Culture

2.4. HR and NHEJ Reporter Assays

2.5. Cellular Fractionation and Immunoblotting

For the cellular fraction assay, the Subcellular Protein Fractionation Kit (Thermo Fisher)

was used according to the manufacturer’s instructions. Protein lysates were quantified us-

ing the BCA reagent (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA). Proteins were resolved

by sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE), transferred to nitrocellulose membranes (Amersham protran, 0.45 µm NC), and immunoblotted with spe-cific primary antibodies followed by HRP–conjugated secondary antibodies. Protein bands were detected using SuperSignal West Pico or Femto Chemiluminescence kit (Thermo Fisher Scientific).

Μετάφραση

Για τη δοκιμή κυτταρικού κλάσματος, το κιτ υποκυτταρικής κλασματοποίησης πρωτεΐνης (Thermo Fisher) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα προϊόντα λύσης πρωτεϊνών ποσοτικοποιήθηκαν – με το αντιδραστήριο BCA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, ΗΠΑ). Οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλοθειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE), μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Amersham protran, 0,45 μm NC) και ανοσοαποτυπώθηκαν με ειδικα πρωτογενή αντισώματα ακολουθούμεθα από δευτερογενή αντισώματα. Οι ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ SuperSignal West Pico ή Femto Chemiluminescence (Thermo Fisher Scientific).

2.6. Comet Assay

2.7. Immunofluorescence

2.8. Analysis of V(D)J Recombination

2.9. Statistical Analysis

3. Results

3.1. Effect of Nuclear–Localized SARS–CoV–2 Viral Proteins on DNA Damage Repair

DNA damage repair occurs mainly in the nucleus to ensure genome stability. Al-

though SARS–CoV–2 proteins are synthesized in the cytosol [1], some viral proteins are

also detectable in the nucleus, including Nsp1, Nsp5, Nsp9, Nsp13, Nsp14, and Nsp16 [19].

We investigated whether these nuclear-localized SARS–CoV–2 proteins affect the host

cell DNA damage repair system. For this, we constructed these viral protein expression

plasmids together with spike and nucleoprotein expression plasmids, which are generally

considered cytosol–localized proteins. We confirmed their expression and localization

by immunoblotting and immunofluorescence (Figures 1A and S1A). Our results were

consistent with those from previous studies [19]; Nsp1, Nsp5, Nsp9, Nsp13, Nsp14, and

Nsp16 proteins are indeed localized in the nucleus, and nucleoproteins are mainly localized

in the cytosol. Surprisingly, we found the abundance of the spike protein in the nucleus

(Figure 1A). NHEJ repair and homologous recombination (HR) repair are two major DNA

repair pathways that not only continuously monitor and ensure genome integrity but are

also vital for adaptive immune cell functions [9]. To evaluate whether these viral proteins

impede the DSB repair pathway, we examined the repair of a site-specific DSB induced by

the I–SceI endonuclease using the direct repeat–green fluorescence protein (DR–GFP) and

the total-NHEJ-GFP (EJ5–GFP) reporter systems for HR and NHEJ, respectively [15,16].

Overexpression of Nsp1, Nsp5, Nsp13, Nsp14, and spike proteins diminished the efficien-

cies of both HR and NHEJ repair (Figures 1B–E and S2A,B). Moreover, we also found

that Nsp1, Nsp5, Nsp13, and Nsp14 overexpression dramatically suppressed proliferation

compared with other studied proteins (Figure S3A,B). Therefore, the inhibitory effect of

Nsp1, Nsp5, Nsp13, and Nsp14 on DNA damage repair may be due to secondary effects,

such as growth arrest and cell death. Interestingly, overexpressed spike protein did not

affect cell morphology or proliferation but significantly suppressed both HR and NHEJ

repair (Figures 1B–E, S2A,B and S3A,B).

3.2. SARS–CoV–2 Spike Protein Inhibits DNA Damage Repair

Because spike proteins are critical for mediating viral entry into host cells and are

the focus of most vaccine strategies [20,21], we further investigated the role of spike

proteins in DNA damage repair and its associated V(D)J recombination. Spike proteins

are usually thought to be synthesized on the rough endoplasmic reticulum (ER) [1]. After

posttranslational modifications such as glycosylation, spike proteins traffic via the cellular

membrane apparatus together with other viral proteins to form the mature virion [1]. Spike

protein contains two major subunits, S1 and S2, as well as several functional domains or

repeats [22] (Figure 2A). In the native state, spike proteins exist as inactive full–length

proteins. During viral infection, host cell proteases such as furin protease activate the S

protein by cleaving it into S1 and S2 subunits, which is necessary for viral entry into the

target cell [23]. We further explored different subunits of the spike protein to elucidate

the functional features required for DNA repair inhibition. Only the full–length spike

protein strongly inhibited both NHEJ and HR repair (Figures 2B–E and S4A,B). Next, we

sought to determine whether the spike protein directly contributes to genomic instability

by inhibiting DSB repair. We monitored the levels of DSBs using comet assays. Following

different DNA damage treatments, such as γ–irradiation, doxorubicin treatment, and H2O2

treatment, there is less repair in the presence of the spike protein (Figure 2F,G). Together,

these data demonstrate that the spike protein directly affects DNA repair in the nucleus.

Εκτιμήσεις και Σχόλια μου

Αποτελέσματα:

3.1

1.

Σε μια τόσο σοβαρή για την κοινωνία έρευνα δεν φυγοκέντρισαν τον πυρήνα ώστε να είμαστε σίγουροι ότι δεν έγιναν αχταρμάς αλλά στηρίχτηκαν σε ομογενοποίηση και διαγνωστικό κιτ;;;;

Σε έναν αχταρμά βρίσκεις τα πάντα και υποθέτεις ότι αυτά βρίσκονται παντού.

2.

Για να εκτιμήσουν την παρεμπόδιση των επιδιορθωτικών μηχανισμών του DNA: we examined the repair of a site-specific DSB induced by the I–SceI endonuclease using the direct repeat–green fluorescence protein (DR–GFP) and the total-NHEJ-GFP (EJ5–GFP) reporter systems for HR and NHEJ, respectively [15,16]. Overexpression of Nsp1, Nsp5, Nsp13, Nsp14, and spike proteins diminished the efficien-cies of both HR and NHEJ repair (Figures 1B–E and S2A,B).

Επειδή βαριέμαι να τα μεταφράζω θα χρησιμοποιήσω κάτι το λαϊκότερο: βλέπω ένα τρένο να περνά και αναφωνώ στην παρέα: 35 ζευγάρια κάνουν σεχ εκεί μέσα. Αυτό φαίνεται και εδώ. Βάλαμε εκείνο και εκείνο και διαπιστώσαμε εξασθένιση των επιδιορθωτικών μηχανισμών. Πως; Με ποιο τρόπο το διαπίστωσαν; Είδαν κάποια παραπροϊόντα; Κάποια τοξικά προϊόντα; Διαπίστωσαν μέσα από την αλληλουχία στρεβλωμένες αλληλουχίες συγκρινόμενες με τις σωστές;;; πως;;;;

3.2

Με το μπλε καταδεικνύεται η πορεία σύνθεσης των ιικων μερών, η μεταφορά και η ενεργοποίηση. Και μετά μας λένε:

We further explored different subunits of the spike protein to elucidate the functional features required for DNA repair inhibition. Only the full–length spike protein strongly inhibited both NHEJ and HR repair (Figures 2B–E and S4A,B). Next, we sought to determine whether the spike protein directly contributes to genomic instability

by inhibiting DSB repair. We monitored the levels of DSBs using comet assays. Following different DNA damage treatments, such as γ–irradiation, doxorubicin treatment, and H2O2 treatment, there is less repair in the presence of the spike protein (Figure 2F,G). Together,

these data demonstrate that the spike protein directly affects DNA repair in the nucleus.

Αλλά δεν μας λένε πως, το πώς. Φτάνουν απ ευθείας σε συμπέρασμα. Και δεν φαίνεται ούτε στα Υλικά και Μέθοδοι το πώς.

3.3

3.3. Spike Proteins Impede the Recruitment of DNA Damage Repair Checkpoint Proteins

Ίδια λογική και εδώ.

Γενικές εκτιμήσεις και παρατηρήσεις μου

Σαν διδάκτωρ από τον Τομέα Βιολογίας Κυττάρου του Πανεπιστήμιου της Πάτρας, εμένα προσωπικά το paper μου δημιουργεί απορίες και με αφήνει με κενά. Αν ασχοληθεί κάποιος γνωστός ή άγνωστος φίλος πιο ειδικός από μένα και εντοπίσει αστοχίες ή λάθη από μέρους μου, παρακαλώ να με ενημερώσει.

Εδώ στο paper όλα είναι in vitro και οι συνθήκες συχνά και η δυναμική και τα αποτελέσματα in vivo μπορεί να είναι τελείως διαφορετικά.

Στην τελευταία ενότητα (4. Discussion) λένε: We propose a potential mechanism by which spike proteins may impair adaptive immunity by inhibiting DNA damage repair. Προτείνουμε ένα πιθανό μηχανισμό. Δηλαδή υποθετικά είναι όλα. Μέχρι να επαληθευτούν.

This suggests that the use of antigenic epitopes of the spike as a SARS–CoV–2 vaccine might be safer and more efficacious than the full–length spike.

Μας λένε δηλαδή ότι η χρήση ενός μέρους είναι πιθανότατα ασφαλέστερη από ολόκληρη την πρωτεϊνική ακίδα, συνεπώς ίσως και το εμβόλιο να είναι ασφαλέστερο.

Αν ισχύουν οι υποθέσεις των ερευνητών φανταστείτε τι μπορεί να κάνει ολόκληρος ο Ίος στον ανθρώπινο οργανισμό.

Αυτό, σε κάποιο σημείο, που λέει ο κος Κλεάνθης Γρίβας περί έκθεσης στο 5G, σε χημικές ουσίες που περιέχονται στα τρόφιμα, σε εξετάσεις μαστογραφίας και στο ηλιακό φως θα προκαλέσουν όλεθρο σε όσους έχουν κάνει εμβόλια mRNA σε μένα τουλάχιστον αφήνουν ερωτηματικά για την σκοπιμότητα εκ μέρους του κου Γρίβα. Διαβάζοντας το paper είναι σαφές ότι οι συγγραφείς του δεν κάνουν τέτοιες αναφορές.

Αυτό περί καρκίνων και εκρήξεις καρκίνων και ανοσοεπάρκειας και αυτοάνοσων αν έχει κάποια βάση τότε όλοι όσοι προσβλήθηκαν από τον ίο ή θα προσβληθούν την ‘έβαψαν’ καθώς εισέρχεται ολόκληρος ο Ίος και ολόκληρη η πρωτεϊνική ακίδα καθώς και πλήθος άλλων πρωτεϊνών του ιού ενώ στους εμβολιασμένους εισέρχεται ένα μόνο μέρος. Και βεβαίως δεν αντιλήφθηκα σε κάποιο σημείο της εργασίας οι ερευνητές να αναφέρονται σε αυτά.

Οι συγγραφείς χρησιμοποιούν συχνά τους όρους: propose / potential / might καταδεικνύοντας την υποθετική φύση όλων των παραπάνω. Το να παίρνει κάποιος άσχετος (με το συγκεκριμένο επιστημονικό τομέα) μια ερευνητική εργασία και να την μετατρέπει σε σίγουρο αποδεικτικό στοιχείο δεν είναι ότι καλύτερο και σε εμένα δημιουργεί σοβαρά ερωτηματικά.

Το ίδιο σκηνικό το έχω ξαναδεί σε μια …. Πατριωτική κίνηση αποτελούμενη από πολλούς πανεπιστημιακούς κα απλά στεναχωρήθηκα. Και φυσικά επαναλαμβάνεται με διάφορα θέματα από διάφορα πρόσωπα σε διάφορα ιστολόγια και σαϊτ. Κλασικό παράδειγμα η ανακοίνωση της ΔΙΣ η οποία προτρέπει τους πιστούς να τηρούν τα μέτρα, να εμβολιαστούν και να κάνουν τεστ. Προτρέπει. Υποχρεωτικά τα τεστ μόνο για τους υπηρετούντες στην εκκλησία. Και τι έγραψαν διάφορα ιστολόγια; μόνο με τεστ οι ανεμβολίαστοι στους ναούς.

Ο πανεπιστημιακός πρέπει να στέκει φάρος και προπύργιο και προμαχώνας της Αλήθειας και όχι να συστρατεύεται σε πολιτικά παιχνίδια και σκοπιμότητες.

Δυστυχώς το ίδιο ακριβώς αντιλαμβάνομαι και από την κυβερνητική πλευρά με τους δικούς της συστρατευμένους επιστήμονες να λένε και αυτοί ψέματα.

Και βλέπω πολλούς συμπολίτες μας να κάθονται στην μέση ανυπεράσπιστοι. Εγώ και κάποιοι έχουμε τις ειδικές γνώσεις να καταλάβουμε που είναι η Αλήθεια. Οι πολλοί όμως;

Και βεβαίως βλέπω πολλούς έτοιμους να προσκολληθούν στο κάθε ψέμα και την κάθε πλάνη και μάλιστα μετά μανίας και πάθους. Προσφέρονται πολλοί άνθρωποι να γίνουν φορείς και μεταφορείς του κάθε ψεύδους και της κάθε πλάνης μετα εξαιρετικής προθυμίας και ευχαρίστησης και αυτό με ανησυχεί ιδιαίτερα.

Εδώ ξεδιπλώνεται ένα θέμα τεράστιας σημασίας με συνέπειες στην πολιτική ζωή. Ο Έλληνας, και ενδεχομένως όλοι άνθρωποι ανεξαρτήτου χρώματος και φυλής, τείνει να γίνει μέρος μια ομάδας ιδεολογικής, θρησκευτικής, εμπορικής κλπ αψηφώντας και παραμελώντας ή αγνοώντας τα όποια αρνητικά, ψέματα και πλάνες. (φυσικά θα αναλυθεί σε επόμενο άρθρο).

Η ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΙΝΑΙ ΣΤΗΝ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΤΟΥ ΝΑ ΚΑΝΟΥΜΕ ΤΟΥΣ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ ΝΑ ΑΓΑΠΟΥΝ ΤΗΝ ΑΛΗΘΕΙΑ.